氧化酚砷对血液肿瘤细胞系的体外效应
作者：孙岳平 贾培敏 蔡循 黄莺 杨洁 沈玉雷 余韵 王振义 陈国强
单位：孙岳平 黄莺 杨洁 陈国强(上海第二医科大学生物学教研室，上海200025)；贾培敏 蔡循 沈玉雷 余韵 王振义(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海200025)
关键词：氧化酚砷；血液肿瘤；凋亡
癌症000107
摘 要：目的：了解氧化酚砷(Phenylarsine oxide,PAO)对血液肿瘤细胞系的影响。方法：8种血液肿瘤系经0.01μmol/L、0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO处理达一定时间后，经台盼蓝排除法计数细胞活力和应用流式细胞仪检测细胞DNA含量分布。结果和结论：在生长抑制和诱导凋亡方面，PAO对血液肿瘤细胞的效应谱相对较广，0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO能抑制某些血液肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡。但是，不同来源的血液肿瘤细胞系对PAO的敏感性不完全相同。
, 百拇医药
分类号：R733 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-027-04
In vitro effects of phenylarsine oxide on hematopoietic
malignant cell lines
SUN Yue ping
(Department of Biology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,P.R China)
JIA Pei-min CAI Xunet al.
(Rui-jin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,P.R. China)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To investigate effects of phenylarsine oxide (PAO) on hematopoietic maligant cell lines. Methods：Eight cell lines from hematopoietic malignancies were treated with 0.01 μ mol/L, 0.05 μ mol/L and 0.1 μ mol/L of PAO for different days. Cell viability was assessed by trypanblau exclusion,and the distribution of cellular DNA contents was measured on flow cytometry. Results and Conclusion：PAO had a wider effect spectrum on hematopoietic malignant cell lines in terms of growth inhibition and apoptosis induction, and 0.05 μ mol/L and 0.1 μ mol/L of PAO could inhibit growth of some hematopoietic malignant cells with or without apoptosis induction. However,cell lines from different origins had the different sensitivity to PAO.
, 百拇医药
Key Words：Phenylarsine oxide; Hematopoietic malignancy; Growth inhibition; Apoptosis ▲
自我国学者发现静脉滴注三氧化二砷(As2O3)可有效治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)，并提出As2O3对APL细胞具有剂量依赖性双重效应，即诱导凋亡和部分分化以来，相关研究引起各国学者的广泛兴趣[1、2]。最近的研究显示药理浓度的As2O3也可导致某些恶性淋巴细胞、多发性骨髓瘤细胞甚至某些实体瘤如神经母细胞等凋亡[3～4]。进一步地，As2O3诱导细胞凋亡的共同机制是破坏线粒体膜通透性转运孔(MPT)，导致线粒体跨膜电位(△Ψm)消失，而巯基可能是其重要靶子[5、6]。我们试图应用亲和层析的方法分离As2O3的靶蛋白。但是，在不能制备结合As2O3的亲和层析柱的情况下，采用其它砷化合物作为其替代品是合理的选择。我们先前的研究显示可用于亲和层析的有机砷化合物——氧化酚砷(Phenylarsine oxide,PAO)能够通过破坏线粒体跨膜电位诱导APL细胞系NB4细胞凋亡[7]。最近，Estrov等[8]也报道0.01～0.1μmol/L的PAO能够抑制急性髓系白血病细胞系OCIM2和OCI/AML3的生长，并诱导其凋亡。他们提出这可能和PAO几乎完全抑制细胞产生IL-1β并抑制IL-1β诱导的NF-κB活化有关。本文试图以源自各种血液肿瘤的细胞系为体外模型，了解PAO对其它血液肿瘤细胞系的影响。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1制剂
PAO粉剂(Sigma公司产品)用DMSO配置成0.1mol/L的储存液，-20℃冻存。临用时稀释至工作浓度。其中，DMSO的使用浓度低于1%。
1.2细胞培养、活力测定和形态学观察
本研究采用的细胞系包括急性髓性白血病细胞K562、U937、HL60，Burkitt-s淋巴瘤细胞Namalwa，慢性淋巴细胞白血病细胞SKW3和多发生骨髓瘤细胞PMI8226和U266细胞。所有细胞系分别以2～3×105/ml个细胞的起始浓度接种于含或不含相应药物的新鲜RPMI1640培养液(内含10%小牛血清和1%青、链霉素)中，在37℃、5%CO2的条件下培养。每日通过加入新鲜培养液和相应药物量，调节细胞密度，使其不超过5×105/ml个细胞。以台盼蓝排除法计数活细胞及细胞活力。药物处理的细胞，经离心、涂片、Wright's染色后在光镜下观察其细胞形态学。
, 百拇医药
1.3流式细胞仪检测凋亡细胞
应用细胞DNA含量分布：细胞经PBS清洗两次后，在75%的冷酒精中4℃过夜。随后，除去酒精，用含1%RNA酶的TrisHCI缓冲液(pH7.4)处理，并以50μg/ml的磺化丙啶(propidium iodide,PI)染色。最后，通过流式细胞仪(COULTER产品，EPICS
-XL)检测细胞DNA含量分布。其中，DNA含量低于G1期的细胞即亚G1期细胞被认为是凋亡细胞。
2结果
2.1PAO对血液肿瘤细胞系生长的影响
根据我们先前的研究和预实验，1.0μmol/L的PAO对细胞具有较大的毒性。因此，本文以0.01～0.1μmol/L作为PAO的使用浓度。结果显示，0.01μmol/L的PAO对所检测的8个细胞系的生长和存活均无明显影响。但是，在0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO的作用下，这些细胞的生长存在不同程度的抑制(表1)。其中，以SKW-3、RPMI8226、Namalwa和Jurkat等恶性淋巴细胞系最敏感。和相应的对照细胞相比，经0.1μmol/L的PAO处理24小时后，这些细胞的生长抑制率分别达94.0±1.7%、82.9±2.9%、77.1±0.8%和57.8±10.3%。但是，这些浓度的PAO对HL60和U937细胞几乎缺乏生长抑制效应。此外。中等程度的生长抑制效应也存在于PAO处理的K562和U266细胞。
, http://www.100md.com
表1 PAO对血液肿瘤细胞系生长和活力的影响 细胞系
处理因素
细胞生长抑制率(
±s%)
细胞活力(±s%)
第一天
第二天
第三天
第一天
第二天
第三天
, 百拇医药
对照
96.4±1.0
96.8±0.5
97.0±0.8
0.05μmol/LPAO
57.0±3.3
77.2±0.5
91.8±3.0
67.6±1.5
63.8±0.3
41.3±3.4
0.01μmol/LPAO
, 百拇医药
94.0±1.7
98.3±0.1
100.0
12.2±2.2
8.3±0.3
0.0
对照
98.0±0.8
98.4±0.9
98.2±1.1
0.05μmol/LPAO
31.9±6.0
, http://www.100md.com
56.3±7.3
79.5±2.0
94.3±1.4
92.5±0.7
85.9±5.7
0.01μmol/LPAO
77.1±0.8
92.5±0.3
99.5±0.5
59.4±3.9
22.6±2.1
4.3±3.7
, 百拇医药
对照
95.5±1.2
95.8±1.6
96.2±1.2
0.05μmol/LPAO
40.3±4.1
51.0±4.0
61.6±4.5
75.9±4.1
75.3±8.9
78.6±6.2
0.01μmol/LPAO
, http://www.100md.com
82.9±2.9
95.0±2.0
0.0
30.8±1.3
16.3±8.4
0.0
对照
96.8±1.3
97.7±1.1
95.3±2.6
0.05μmol/LPAO
24.2±24.8
, 百拇医药
42.1±6.6
42.7±9.5
91.7±1.4
92.2±1.4
95.6±2.4
0.01μmol/LPAO
57.8±10.3
74.9±3.5
82.3±2.5
67.2±5.9
75.4±12.9
67.9±5.9
, http://www.100md.com
对照
97.2±0.7
97.5±1.6
99.3±1.2
0.05μmol/LPAO
24.2±1.9
30.0±6.4
35.5±4.5
95.1±1.9
95.0±2.5
95.7±2.1
0.01μmol/LPAO
, 百拇医药
41.2±5.9
53.5±2.0
66.6±2.5
89.6±1.1
81.4±2.5
73.0±5.5
对照
94.4±2.7
97.1±1.3
97.5±1.0
0.05μmol/LPAO
7.5±2.7
, http://www.100md.com
5.1±1.6
3.6±1.1
93.2±1.6
97.2±0.5
97.7±0.3
0.01μmol/LPAO
34.6±12.2
43.3±4.8
56.8±14.3
87.6±1.8
88.8±1.6
92.5±1.0
, 百拇医药
对照
96.2±2.4
93.9±2.3
95.2±1.1
0.05μmol/LPAO
9.0±3.9
0.0
1.9±10.3
94.5±2.2
93.9±1.5
94.0±2.8
0.01μmol/LPAO
, http://www.100md.com
5.5±5.3
8.5±10.8
10.4±4.7
94.5±2.3
95.2±2.0
94.5±2.0
对照
99.0±1.1
99.0±1.1
98.4±0.5
0.05μmol/LPAO
4.0±4.6
, 百拇医药
5.5±4.3
0.0
99.0±0.8
99.1±0.7
98.1±0.7
0.01μmol/LPAO
6.8±8.7
6.8±9.0
21±4.9
99.3±06
98.9±0.1
98.8±0.1
, 百拇医药
2.2PAO对血液肿瘤细胞系活力的影响
如表1所示，0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO明显降低SKW-3细胞的活力。当0.1μmol/L的PAO处理达2～3天时，几乎所有的SKW-3细胞死亡。在0.05μmol/L的PAO作用3天后，死亡的SKW3细胞也达到50%。在0.1μmol/L的PAO作用下，Namalwa和RPMI8226细胞的活力呈现时间依赖性下降，Jurkat和U266细胞的活力轻度下降。但是，在0.05μmol/L的PAO作用下，除RPMI8226细胞外，其它三个细胞系(Namalwa、Jurkat和U266)的活力几乎无明显改变。此外，无论是0.05μmol/L还是0.1μmol/L的PAO对K562、HL60和U937的活力都无明显影响。
2.3PAO诱导血液肿瘤细胞凋亡
上述研究提示0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO对检测的大多数血液肿瘤细胞系存在生长抑制和(或)死亡诱导效应。为了检测PAO诱导细胞死亡的形式，本文应用细胞流式仪检测细胞DNA的含量分布。结果发现在0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO作用1～3天的K562、HL60、U937和Jurkat细胞中不出现亚G1期细胞。后者也不存在于0.05μmol/L的PAO处理的RPMI8226和Namalwa细胞。当SKW-3细胞在0.05μmol/L的PAO处理达3天时，亚G1期细胞达24.8%。但是，在0.1μmol/L的PAO处理的SKW-3、RPMI8226和Namalwa细胞群中，亚G1期细胞呈现时间依赖性增加(图1)。例如，在0.1μmol/L的PAO处理1天时，SKW-3、RPMI8226和Namalwa细胞群中亚G1期细胞分别为46.5%、41.5%和21.4%。在0.1μmol/L的PAO处理2天时，它们分别为85.1%、100%和53.1%。进一步地，在这些处理中出现数量不等的细胞呈现凋亡细胞的特征性形态学改变(图2)。
, 百拇医药
图1 流式细胞仪检测细胞DNA含量分布
(a和b/c分别表示相应细胞经0.05μmol/LPAO和0.1μmol/LPAO处理达2天和1天，
表示凋亡细胞)
图2 细胞形态学观察
3讨论
PAO是一种三价砷化合物，能与蛋白质分子上相邻或相近的巯基形成稳定的环状复合物[9]。本研究显示，在生长抑制和诱导凋亡方面，PAO在血液肿瘤的效应谱和As2O3一样相对较广。但是，不同来源的血液肿瘤细胞显示对PAO有着不同的敏感性。依据这些细胞对PAO的反应，大致可划分为四类：(1)高敏感细胞，如SKW-3、Namalwa和RPMI8226细胞。这些细胞经0.1μmol/L的PAO处理24小时后，生长和活力同时受到明显抑制；(2)敏感细胞，如NB4、U266和Jurkat细胞，这类细胞的生长和存活虽然都受到影响，但其程度小于第一类细胞，如NB4细胞经0.1μmol/L的PAO处理72小时后，生长抑制率和活力分别在70%和50%左右[7]；(3)低敏感细胞，这类细胞生长受到抑制，但活力无明显影响，如K562细胞。经0.1μmol/L的PAO处理达3天的K562细胞的活力仍保持在92.5±1.0%，但其生长抑制率达56.8±14.3；(4)不敏感细胞，这是一类生长和活力都无明显影响的细胞，如HL60和U937细胞。过去，我们的研究显示1.0μmol/L的AAs2O3通过诱导细胞凋亡抑制SKW-3、Namalwa、RPMI8226和U266细胞的生长，而对HL60和U937细胞的生长和活力无明显影响[1、5]。此外，1.0μmol/LAs2O3也抑制K562细胞的生长，但并不诱导其凋亡。这些结果提示PAO和As2O3存在相似的生长抑制和诱导凋亡效应谱，但PAO对这些细胞的效应明显大于As2O3，这可能与PAO和蛋白质相邻巯基的高亲和力有关。
, http://www.100md.com
新近研究表明，恶性肿瘤细胞对As2O3作用的敏感性与细胞内GSH或过氧化氢酶活性相关。调节细胞GSH的水平影响细胞对As2O3的敏感性[9]。已知，GSH是细胞主要的抗氧化剂，能清除胞内的自由基，解消毒物和化疗药物的毒性。砷剂和细胞内的GSH结合，形成过渡性的As(GS)3从而削弱GSH对细胞的保护作用。PAO对这些细胞的凋亡诱导效应是否与GSH系统有关，尚待进一步的研究。已知PAO是酪氨酸磷酸酯酶的广谱抑制剂。通过调节细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化水平，低浓度(0.1～1.0μmol/L)的PAO可诱导人嗜中性、嗜酸性粒细胞的凋亡[10]。此外，它对不同的细胞有着多重效应[11]，如抑制NADPH氧化酶的活化，调节线粒体的膜通透性，抑制肿瘤坏死因子TNF依赖的核转录因子NF-κB的活化等。我们最近的研究显示，PAO能够通过破坏线粒体跨膜电位诱导APL细胞系NB4细胞凋亡[7]。这些结果提示，PAO诱导细胞凋亡时，在细胞中可能有着多重靶位或靶分子，或者，PAO对不同的细胞有不同的作用机制。像PAO对细胞的这种多重作用效应，将为我们进一步探讨砷剂诱导细胞的凋亡机制提供多方位的启示。对PAO诱导细胞凋亡的机制进行研究也将有助于揭开As2O3诱导细胞凋亡的机制问题。
, http://www.100md.com
通讯作者：Tel：86-21-63846590-415
Email：jysws@shsmu.edu.cn
参考文献：
[1]Chen GQ,Zhu J,Shj XG,et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia： As2O3 induce NB4 cell apoptosis with downregulation of Bc1-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins[J]. Blood,1996,88： 1052～ 1061.
, 百拇医药
[2]Soignet SL,Maslak P,Wang ZG,et al.Complete remission after treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic trioxide[J]. N EngI J Med,1998,339： 1341～ 1348.
[3]Bazarbachi A,El-Sabban ME,Nasr R,et al. Arsenic trioxide and interferon-alpha synergixa to induce cell cycle arrest and apoptosis in human T-cell Lymphotropic virus type I-transformed cells[J]. Blood,1999,93： 278～ 283.
[4]Shen ZY, Tan LJ,Cai WJ,et al.Arsenic trioxide induces apoptosis of oesophageal carcinoma in vitro[J]. Int J Mol Med,1999, 4： 33～ 37.
, http://www.100md.com
[5]Zhu XH, Shen YL, Jing YK, et al. Apoptosis and growth inhibition in malignant lymphocytes after treatment with arsenic trioxide at clinically achievable concentrations[J]. J Natl Cancer Inst,1999,91： 772～ 778.
[6]Larochette N,Decaudin D,Jacotot E,et al.Arsenite induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore[J]. Exp Cell Res,1999,249： 413～ 421.
[7]孙岳平，陈国强，蔡循，等.氧化酚砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞凋亡的研究[J].癌症，1999，1：1～4.
, 百拇医药
[8]Estrov Z,Manna SK,Harris D,et al.Phenylarsine oxide blocks interleukin-1 beta-induced activation of the nuclear transcription factor NF-kappaB,inhibits proliferation,and induces apoptosis of acute myelogenous leukemia cells[J]. Blood, 1999;94： 2844～ 2853.
[9] Dai J,Weunberg RS,Waxman S, et al.Malignant cells can be sensitized to undergo growth inhibition and apoptosis by arxenic trioxide through modulation of the glutathione redox system[J]. Blood,1999,93： 268～ 277.
, 百拇医药
[10]Yousefi S,Green D,Blaser K,et al. Protein-tyrosine phosphorylation regulates apoptosis in human eosinophils and neutrophils[J]. Proc Natl Sci USA,1994,91： 10868～ 10872.
[11]Doussiere J,Poinas A,Blais C, et al. Phenylarsine oxide as an inhibitor of the activation of the neutrophil NADPH oxidase -identification of beta subunit of the flavocytochrome b component of the NADH oxidaseas a target side for phenylorsine oxide by photoaffinity labeling and phtoinactivation[J]. Eur J Biochem,1998,251： 649～ 658.
收稿日期：1999-10-29, http://www.100md.com
单位：孙岳平 黄莺 杨洁 陈国强(上海第二医科大学生物学教研室，上海200025)；贾培敏 蔡循 沈玉雷 余韵 王振义(上海第二医科大学附属瑞金医院，上海200025)
关键词：氧化酚砷；血液肿瘤；凋亡
癌症000107
摘 要：目的：了解氧化酚砷(Phenylarsine oxide,PAO)对血液肿瘤细胞系的影响。方法：8种血液肿瘤系经0.01μmol/L、0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO处理达一定时间后，经台盼蓝排除法计数细胞活力和应用流式细胞仪检测细胞DNA含量分布。结果和结论：在生长抑制和诱导凋亡方面，PAO对血液肿瘤细胞的效应谱相对较广，0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO能抑制某些血液肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡。但是，不同来源的血液肿瘤细胞系对PAO的敏感性不完全相同。
, 百拇医药
分类号：R733 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-027-04
In vitro effects of phenylarsine oxide on hematopoietic
malignant cell lines
SUN Yue ping
(Department of Biology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,P.R China)
JIA Pei-min CAI Xunet al.
(Rui-jin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025,P.R. China)
, 百拇医药
Abstract：Objective：To investigate effects of phenylarsine oxide (PAO) on hematopoietic maligant cell lines. Methods：Eight cell lines from hematopoietic malignancies were treated with 0.01 μ mol/L, 0.05 μ mol/L and 0.1 μ mol/L of PAO for different days. Cell viability was assessed by trypanblau exclusion,and the distribution of cellular DNA contents was measured on flow cytometry. Results and Conclusion：PAO had a wider effect spectrum on hematopoietic malignant cell lines in terms of growth inhibition and apoptosis induction, and 0.05 μ mol/L and 0.1 μ mol/L of PAO could inhibit growth of some hematopoietic malignant cells with or without apoptosis induction. However,cell lines from different origins had the different sensitivity to PAO.
, 百拇医药
Key Words：Phenylarsine oxide; Hematopoietic malignancy; Growth inhibition; Apoptosis ▲
自我国学者发现静脉滴注三氧化二砷(As2O3)可有效治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)，并提出As2O3对APL细胞具有剂量依赖性双重效应，即诱导凋亡和部分分化以来，相关研究引起各国学者的广泛兴趣[1、2]。最近的研究显示药理浓度的As2O3也可导致某些恶性淋巴细胞、多发性骨髓瘤细胞甚至某些实体瘤如神经母细胞等凋亡[3～4]。进一步地，As2O3诱导细胞凋亡的共同机制是破坏线粒体膜通透性转运孔(MPT)，导致线粒体跨膜电位(△Ψm)消失，而巯基可能是其重要靶子[5、6]。我们试图应用亲和层析的方法分离As2O3的靶蛋白。但是，在不能制备结合As2O3的亲和层析柱的情况下，采用其它砷化合物作为其替代品是合理的选择。我们先前的研究显示可用于亲和层析的有机砷化合物——氧化酚砷(Phenylarsine oxide,PAO)能够通过破坏线粒体跨膜电位诱导APL细胞系NB4细胞凋亡[7]。最近，Estrov等[8]也报道0.01～0.1μmol/L的PAO能够抑制急性髓系白血病细胞系OCIM2和OCI/AML3的生长，并诱导其凋亡。他们提出这可能和PAO几乎完全抑制细胞产生IL-1β并抑制IL-1β诱导的NF-κB活化有关。本文试图以源自各种血液肿瘤的细胞系为体外模型，了解PAO对其它血液肿瘤细胞系的影响。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1制剂
PAO粉剂(Sigma公司产品)用DMSO配置成0.1mol/L的储存液，-20℃冻存。临用时稀释至工作浓度。其中，DMSO的使用浓度低于1%。
1.2细胞培养、活力测定和形态学观察
本研究采用的细胞系包括急性髓性白血病细胞K562、U937、HL60，Burkitt-s淋巴瘤细胞Namalwa，慢性淋巴细胞白血病细胞SKW3和多发生骨髓瘤细胞PMI8226和U266细胞。所有细胞系分别以2～3×105/ml个细胞的起始浓度接种于含或不含相应药物的新鲜RPMI1640培养液(内含10%小牛血清和1%青、链霉素)中，在37℃、5%CO2的条件下培养。每日通过加入新鲜培养液和相应药物量，调节细胞密度，使其不超过5×105/ml个细胞。以台盼蓝排除法计数活细胞及细胞活力。药物处理的细胞，经离心、涂片、Wright's染色后在光镜下观察其细胞形态学。
, 百拇医药
1.3流式细胞仪检测凋亡细胞
应用细胞DNA含量分布：细胞经PBS清洗两次后，在75%的冷酒精中4℃过夜。随后，除去酒精，用含1%RNA酶的TrisHCI缓冲液(pH7.4)处理，并以50μg/ml的磺化丙啶(propidium iodide,PI)染色。最后，通过流式细胞仪(COULTER产品，EPICS
-XL)检测细胞DNA含量分布。其中，DNA含量低于G1期的细胞即亚G1期细胞被认为是凋亡细胞。2结果
2.1PAO对血液肿瘤细胞系生长的影响
根据我们先前的研究和预实验，1.0μmol/L的PAO对细胞具有较大的毒性。因此，本文以0.01～0.1μmol/L作为PAO的使用浓度。结果显示，0.01μmol/L的PAO对所检测的8个细胞系的生长和存活均无明显影响。但是，在0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO的作用下，这些细胞的生长存在不同程度的抑制(表1)。其中，以SKW-3、RPMI8226、Namalwa和Jurkat等恶性淋巴细胞系最敏感。和相应的对照细胞相比，经0.1μmol/L的PAO处理24小时后，这些细胞的生长抑制率分别达94.0±1.7%、82.9±2.9%、77.1±0.8%和57.8±10.3%。但是，这些浓度的PAO对HL60和U937细胞几乎缺乏生长抑制效应。此外。中等程度的生长抑制效应也存在于PAO处理的K562和U266细胞。
, http://www.100md.com
表1 PAO对血液肿瘤细胞系生长和活力的影响 细胞系
处理因素
细胞生长抑制率(
±s%)细胞活力(
±s%)第一天
第二天
第三天
第一天
第二天
第三天
, 百拇医药
对照
96.4±1.0
96.8±0.5
97.0±0.8
0.05μmol/LPAO
57.0±3.3
77.2±0.5
91.8±3.0
67.6±1.5
63.8±0.3
41.3±3.4
0.01μmol/LPAO
, 百拇医药
94.0±1.7
98.3±0.1
100.0
12.2±2.2
8.3±0.3
0.0
对照
98.0±0.8
98.4±0.9
98.2±1.1
0.05μmol/LPAO
31.9±6.0
, http://www.100md.com
56.3±7.3
79.5±2.0
94.3±1.4
92.5±0.7
85.9±5.7
0.01μmol/LPAO
77.1±0.8
92.5±0.3
99.5±0.5
59.4±3.9
22.6±2.1
4.3±3.7
, 百拇医药
对照
95.5±1.2
95.8±1.6
96.2±1.2
0.05μmol/LPAO
40.3±4.1
51.0±4.0
61.6±4.5
75.9±4.1
75.3±8.9
78.6±6.2
0.01μmol/LPAO
, http://www.100md.com
82.9±2.9
95.0±2.0
0.0
30.8±1.3
16.3±8.4
0.0
对照
96.8±1.3
97.7±1.1
95.3±2.6
0.05μmol/LPAO
24.2±24.8
, 百拇医药
42.1±6.6
42.7±9.5
91.7±1.4
92.2±1.4
95.6±2.4
0.01μmol/LPAO
57.8±10.3
74.9±3.5
82.3±2.5
67.2±5.9
75.4±12.9
67.9±5.9
, http://www.100md.com
对照
97.2±0.7
97.5±1.6
99.3±1.2
0.05μmol/LPAO
24.2±1.9
30.0±6.4
35.5±4.5
95.1±1.9
95.0±2.5
95.7±2.1
0.01μmol/LPAO
, 百拇医药
41.2±5.9
53.5±2.0
66.6±2.5
89.6±1.1
81.4±2.5
73.0±5.5
对照
94.4±2.7
97.1±1.3
97.5±1.0
0.05μmol/LPAO
7.5±2.7
, http://www.100md.com
5.1±1.6
3.6±1.1
93.2±1.6
97.2±0.5
97.7±0.3
0.01μmol/LPAO
34.6±12.2
43.3±4.8
56.8±14.3
87.6±1.8
88.8±1.6
92.5±1.0
, 百拇医药
对照
96.2±2.4
93.9±2.3
95.2±1.1
0.05μmol/LPAO
9.0±3.9
0.0
1.9±10.3
94.5±2.2
93.9±1.5
94.0±2.8
0.01μmol/LPAO
, http://www.100md.com
5.5±5.3
8.5±10.8
10.4±4.7
94.5±2.3
95.2±2.0
94.5±2.0
对照
99.0±1.1
99.0±1.1
98.4±0.5
0.05μmol/LPAO
4.0±4.6
, 百拇医药
5.5±4.3
0.0
99.0±0.8
99.1±0.7
98.1±0.7
0.01μmol/LPAO
6.8±8.7
6.8±9.0
21±4.9
99.3±06
98.9±0.1
98.8±0.1
, 百拇医药
2.2PAO对血液肿瘤细胞系活力的影响
如表1所示，0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO明显降低SKW-3细胞的活力。当0.1μmol/L的PAO处理达2～3天时，几乎所有的SKW-3细胞死亡。在0.05μmol/L的PAO作用3天后，死亡的SKW3细胞也达到50%。在0.1μmol/L的PAO作用下，Namalwa和RPMI8226细胞的活力呈现时间依赖性下降，Jurkat和U266细胞的活力轻度下降。但是，在0.05μmol/L的PAO作用下，除RPMI8226细胞外，其它三个细胞系(Namalwa、Jurkat和U266)的活力几乎无明显改变。此外，无论是0.05μmol/L还是0.1μmol/L的PAO对K562、HL60和U937的活力都无明显影响。
2.3PAO诱导血液肿瘤细胞凋亡
上述研究提示0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO对检测的大多数血液肿瘤细胞系存在生长抑制和(或)死亡诱导效应。为了检测PAO诱导细胞死亡的形式，本文应用细胞流式仪检测细胞DNA的含量分布。结果发现在0.05μmol/L和0.1μmol/L的PAO作用1～3天的K562、HL60、U937和Jurkat细胞中不出现亚G1期细胞。后者也不存在于0.05μmol/L的PAO处理的RPMI8226和Namalwa细胞。当SKW-3细胞在0.05μmol/L的PAO处理达3天时，亚G1期细胞达24.8%。但是，在0.1μmol/L的PAO处理的SKW-3、RPMI8226和Namalwa细胞群中，亚G1期细胞呈现时间依赖性增加(图1)。例如，在0.1μmol/L的PAO处理1天时，SKW-3、RPMI8226和Namalwa细胞群中亚G1期细胞分别为46.5%、41.5%和21.4%。在0.1μmol/L的PAO处理2天时，它们分别为85.1%、100%和53.1%。进一步地，在这些处理中出现数量不等的细胞呈现凋亡细胞的特征性形态学改变(图2)。
, 百拇医药
图1 流式细胞仪检测细胞DNA含量分布
(a和b/c分别表示相应细胞经0.05μmol/LPAO和0.1μmol/LPAO处理达2天和1天，
表示凋亡细胞)图2 细胞形态学观察
3讨论
PAO是一种三价砷化合物，能与蛋白质分子上相邻或相近的巯基形成稳定的环状复合物[9]。本研究显示，在生长抑制和诱导凋亡方面，PAO在血液肿瘤的效应谱和As2O3一样相对较广。但是，不同来源的血液肿瘤细胞显示对PAO有着不同的敏感性。依据这些细胞对PAO的反应，大致可划分为四类：(1)高敏感细胞，如SKW-3、Namalwa和RPMI8226细胞。这些细胞经0.1μmol/L的PAO处理24小时后，生长和活力同时受到明显抑制；(2)敏感细胞，如NB4、U266和Jurkat细胞，这类细胞的生长和存活虽然都受到影响，但其程度小于第一类细胞，如NB4细胞经0.1μmol/L的PAO处理72小时后，生长抑制率和活力分别在70%和50%左右[7]；(3)低敏感细胞，这类细胞生长受到抑制，但活力无明显影响，如K562细胞。经0.1μmol/L的PAO处理达3天的K562细胞的活力仍保持在92.5±1.0%，但其生长抑制率达56.8±14.3；(4)不敏感细胞，这是一类生长和活力都无明显影响的细胞，如HL60和U937细胞。过去，我们的研究显示1.0μmol/L的AAs2O3通过诱导细胞凋亡抑制SKW-3、Namalwa、RPMI8226和U266细胞的生长，而对HL60和U937细胞的生长和活力无明显影响[1、5]。此外，1.0μmol/LAs2O3也抑制K562细胞的生长，但并不诱导其凋亡。这些结果提示PAO和As2O3存在相似的生长抑制和诱导凋亡效应谱，但PAO对这些细胞的效应明显大于As2O3，这可能与PAO和蛋白质相邻巯基的高亲和力有关。
, http://www.100md.com
新近研究表明，恶性肿瘤细胞对As2O3作用的敏感性与细胞内GSH或过氧化氢酶活性相关。调节细胞GSH的水平影响细胞对As2O3的敏感性[9]。已知，GSH是细胞主要的抗氧化剂，能清除胞内的自由基，解消毒物和化疗药物的毒性。砷剂和细胞内的GSH结合，形成过渡性的As(GS)3从而削弱GSH对细胞的保护作用。PAO对这些细胞的凋亡诱导效应是否与GSH系统有关，尚待进一步的研究。已知PAO是酪氨酸磷酸酯酶的广谱抑制剂。通过调节细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化水平，低浓度(0.1～1.0μmol/L)的PAO可诱导人嗜中性、嗜酸性粒细胞的凋亡[10]。此外，它对不同的细胞有着多重效应[11]，如抑制NADPH氧化酶的活化，调节线粒体的膜通透性，抑制肿瘤坏死因子TNF依赖的核转录因子NF-κB的活化等。我们最近的研究显示，PAO能够通过破坏线粒体跨膜电位诱导APL细胞系NB4细胞凋亡[7]。这些结果提示，PAO诱导细胞凋亡时，在细胞中可能有着多重靶位或靶分子，或者，PAO对不同的细胞有不同的作用机制。像PAO对细胞的这种多重作用效应，将为我们进一步探讨砷剂诱导细胞的凋亡机制提供多方位的启示。对PAO诱导细胞凋亡的机制进行研究也将有助于揭开As2O3诱导细胞凋亡的机制问题。
, http://www.100md.com
通讯作者：Tel：86-21-63846590-415
Email：jysws@shsmu.edu.cn
参考文献：
[1]Chen GQ,Zhu J,Shj XG,et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia： As2O3 induce NB4 cell apoptosis with downregulation of Bc1-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins[J]. Blood,1996,88： 1052～ 1061.
, 百拇医药
[2]Soignet SL,Maslak P,Wang ZG,et al.Complete remission after treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic trioxide[J]. N EngI J Med,1998,339： 1341～ 1348.
[3]Bazarbachi A,El-Sabban ME,Nasr R,et al. Arsenic trioxide and interferon-alpha synergixa to induce cell cycle arrest and apoptosis in human T-cell Lymphotropic virus type I-transformed cells[J]. Blood,1999,93： 278～ 283.
[4]Shen ZY, Tan LJ,Cai WJ,et al.Arsenic trioxide induces apoptosis of oesophageal carcinoma in vitro[J]. Int J Mol Med,1999, 4： 33～ 37.
, http://www.100md.com
[5]Zhu XH, Shen YL, Jing YK, et al. Apoptosis and growth inhibition in malignant lymphocytes after treatment with arsenic trioxide at clinically achievable concentrations[J]. J Natl Cancer Inst,1999,91： 772～ 778.
[6]Larochette N,Decaudin D,Jacotot E,et al.Arsenite induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore[J]. Exp Cell Res,1999,249： 413～ 421.
[7]孙岳平，陈国强，蔡循，等.氧化酚砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞凋亡的研究[J].癌症，1999，1：1～4.
, 百拇医药
[8]Estrov Z,Manna SK,Harris D,et al.Phenylarsine oxide blocks interleukin-1 beta-induced activation of the nuclear transcription factor NF-kappaB,inhibits proliferation,and induces apoptosis of acute myelogenous leukemia cells[J]. Blood, 1999;94： 2844～ 2853.
[9] Dai J,Weunberg RS,Waxman S, et al.Malignant cells can be sensitized to undergo growth inhibition and apoptosis by arxenic trioxide through modulation of the glutathione redox system[J]. Blood,1999,93： 268～ 277.
, 百拇医药
[10]Yousefi S,Green D,Blaser K,et al. Protein-tyrosine phosphorylation regulates apoptosis in human eosinophils and neutrophils[J]. Proc Natl Sci USA,1994,91： 10868～ 10872.
[11]Doussiere J,Poinas A,Blais C, et al. Phenylarsine oxide as an inhibitor of the activation of the neutrophil NADPH oxidase -identification of beta subunit of the flavocytochrome b component of the NADH oxidaseas a target side for phenylorsine oxide by photoaffinity labeling and phtoinactivation[J]. Eur J Biochem,1998,251： 649～ 658.
收稿日期：1999-10-29, http://www.100md.com